• Россия, 664033, г. Иркутск,
    ул. Лермонтова, д.132
  • (3952) 42-67-21
Константинов Юрий Михайлович, д.б.н., зав. лабораторией генетической инженерии растений Заведующий лабораторией генетической инженерии растений
Константинов Юрий Михайлович, д.б.н., профессор
e-mail: Этот адрес электронной почты защищён от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.

Лаборатория основана в 1989 году (с 1982 года существовала в статусе группы генетической инженерии растений).

На протяжении всего периода существования лаборатории генетической инженерии растений Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН в центре ее научных интересов находится проблема структурно-функциональной организации генома растительных митохондрий и разработки принципов его направленного изменения.  При этом исследования ведутся по следующим основным направлениям:

  1. Исследование редокс-регуляции генетических функций митохондрий
  2. Изучение импорта ДНК в митохондрии в системе in organello
  3. Генетическая трансформация митохондрий растений путем введения целевых генов в системе in vivo

Редокс-регуляция генетических функций митохондрий как способ интеграции генома митохондрий в единую генетическую систему растительной клетки

Функционирование митохондрий – источника энергии в растительной клетке – основано на окислительно-восстановительных реакциях. Обнаружено, что редокс-условия оказывают комплексное воздействие на генетические процессы в митохондриях. Коллективом впервые установлено существование редокс-контроля транскрипции и трансляции в митохондриях высших растений (Zea mays, Elymus sibiricus): в условиях окисления наблюдается активация этих процессов, тогда как в условиях восстановления, напротив, отмечается их репрессия. Обнаружены также изменения активности синтеза РНК и ДНК в изолированных митохондриях кукурузы в присутствии ингибиторов протеинкиназ и протеинфосфатаз, свидетельствующие об участии фосфорилирования белков в контроле генетических функций митохондрий. Кроме того, установлено, что ингибиторы протеинкиназ и протеинфосфатаз модифицируют эффекты редокс-агентов на активность синтеза белка в митохондриях злаков. Предположено, что фосфорилирование белков в митохондриях может быть одним из механизмов, опосредующих связь между редокс-состоянием дыхательной цепи и активностью митохондриальной трансляции.

Выделение и изучение нескольких белковых факторов, участвующих в экспрессии генома органелл, показало, что данные белки могут опосредовать редокс-ответ митохондриальной генетической системы. Так, впервые осуществлена очистка и охарактеризованы свойства ДНК-топоизомеразы I – фермента, контролирующего конформационное состояние ДНК - из митохондрий кукурузы. Обнаружен феномен редокс-модуляции активности митохондриальной топоизомеразы I однодольных (кукуруза) и двудольных (морковь) растений. В условиях окисления, создаваемых добавлением химических редокс-модуляторов или окисленного глутатиона, наблюдается снижение активности фермента, тогда как в условиях восстановления, в частности в присутствии восстановленной формы глутатиона, происходит активация топоизомеразы I.

Коллективом осуществлена очистка ДНК-связывающего белка из митохондрий кукурузы, проявляющего избирательное сродство к промоторной области определенного митохондриального гена, cox1. Показано, что характерный для ряда митохондриальных промоторов однодольных растений мотив AAGTA необходим для связывания с ДНК. С использованием комбинации методов электрофоретического замедления в геле и элюции из ПААГ продемонстрировано наличие в составе образующегося ДНК-белкового комплекса трех полипептидов с молекулярной массой 60, 44 и 22 кДа.  Установлено, что регуляция активности этого фактора осуществляется с участием реакций фосфорилирования/дефосфорилирования и тиол-дисульфидного обмена. Впервые обнаруженное наличие редокс-чувствительных свойств у митохондриального промотор-специфичного ДНК-связывающего белкового фактора служит указанием на его вовлеченность в молекулярные механизмы редокс-регуляции транскрипции митохондриальных генов растений.

В лаборатории впервые установлено влияние редокс-состояния электрон-транспортной цепи митохондрий на транскрипцию индивидуальных митохондриальных генов растений. Обнаружена дифференциальная экспрессия генов, кодирующих субъединицы (cox1, cox3, cob) в составе комплексов дыхательной цепи, АТФазного комплекса (atp9) и рибосомальный белок (rps13) в проростках кукурузы, обработанных антимицином А, салицилгидроксамовой кислотой или их смесью. Установленный факт указывает на вовлеченность редокс-состояния электрон-транспортной цепи и, возможно, уровня активных форм кислорода в регуляцию экспрессии митохондриальных генов in vivo.

 

(А) Влияние ингибиторов трех комплексов дыхательной цепи на содержание транскриптов гена gdh2 в суспензии клеток арабидопсиса.

(Б) Влияние ингибиторов протеинкиназ и протеинфосфатаз на индукцию генов gdh2 и aox1a под воздействием антимицина А. Предобработка клеток эндоталом и стауроспорином производилась за 30 мин до добавления антимицина А. В качестве контроля приведен уровень транскриптов ядерного гена fro1 и митохондриального гена cox3.

Обнаружена зависимость экспрессии ядерного гена gdh2, кодирующего бета-субъединицу митохондриальной глутаматдегидрогеназы, от редокс-состояния электрон-транспортной цепи митохондрий. Отмечено, что обработка суспензии клеток арабидопсиса антимицином А приводит к увеличению содержания транскриптов gdh2 уже через 2 ч обработки. Ингибирование комплекса I при добавлении ротенона не оказывает какого-либо воздействия на уровень транскриптов. В то же время обработка ингибитором комплекса IV цианидом калия вызывает увеличение содержания транскриптов. Таким образом, экспрессия гена gdh2, по-видимому, реагирует на изменения состояния дыхательной цепи на участке, локализованном между первым и третьим комплексом. Отсутствие активации экспрессии гена при обработке суспензии клеток перекисью водорода и прооксидантом паракватом, а также результаты экспериментов с использованием антиоксидантов позволяют считать, что выявленный эффект не связан с увеличением содержания генерируемых при ингибировании электрон-транспортной цепи активных форм кислорода. Показано, что фосфорилирование белков, осуществляемое серин/треониновыми протеинкиназами – необходимый этап в процессе передачи сигнала об индукции экспрессии gdh2 в ядро.

Внешний облик растений дикого типа (Col0) и мутантной линии (Fro-) на стадии начала образования цветоносного побега


Проведена характеристика линий Arabidopsis thaliana, полученных путем инсерционного мутагенеза гена fro (at5g67590), кодирующего Fe-S-содержащую субъединицу комплекса I митохондриальной дыхательной цепи. Полученные гомозиготы обладают целым рядом фенотипических особенностей, таких как более позднее прорастание семян, замедленный рост и развитие, увеличенное количество и темно-зеленая окраска листьев. Показано, что растения с инактивированным геном fro в конечном итоге наращивают биомассу, сходную с таковой растений дикого типа, и обладают нормальной продуктивностью. Исследование внутриклеточного уровня активных форм кислорода в полученных нами суспензионных культурах клеток контрольной линии и линии Fro- выявило ощутимые различия между этими линиями. Показано сниженное образование супероксидного радикала мутантными клетками. Обнаружены также отличия в степени возрастания уровня другой АФК, перекиси водорода, в ответ на стрессовые воздействия. Уровень перекиси в клетках, обработанных прооксидантом менадионом и собственно перекисью водорода, возрастал в несколько раз в клетках дикого типа, однако оставался почти неизменным в клетках линии Fro-. Кроме того, показано, что в условиях недостаточного увлажнения при высоком уровне освещенности растения контрольной линии накапливают в листьях в несколько раз большее количество антоцианов, чем мутантные растения. Таким образом, растения с модифицированным комплексом I оказываются более устойчивыми к данному стрессовому воздействию. На основании полученных данных предположено, что отсутствие Fe-S-субъединицы (и функционального комплекса I в целом) ведет к разнообразным перестройкам сигнальных и метаболических путей, приводящим в итоге к компенсации дефекта и даже повышенной стресс-устойчивости растения

Исследование молекулярных механизмов импорта ДНК в митохондрии

Членами коллектива открыто явление переноса ДНК во внутреннее пространство растительных митохондрий. Показано, что изолированные растительные митохондрии способны импортировать двухцепочечную ДНК посредством активного, не зависящего от последовательности ДНК процесса. Установлено, что эффективность импорта ДНК в митохондрии зависит как от физической формы молекулы (линейные молекулы транспортируются намного эффективнее, чем кольцевые), так и от ее размера (с увеличением длины импортируемого субстрата импорт ухудшается). 

Продемонстрирована возможность экспрессии in organello чужеродных генов, транспортируемых в митохондрии в составе векторной генетической конструкции на основе линейной (2,3 тпн) плазмидоподобной ДНК кукурузы: ген GFP (green fluorescent protein), находящийся под контролем промоторной последовательности митохондриального гена 18S рибосомальной РНК картофеля и регуляторной зоны гена atp1 табака, а также открытая рамка считывания (orf1) в составе митохондриальной плазмиды кукурузы способны к эффективной транскрипции в митохондриях картофеля.

Транскрипция импортируемой ДНК в растительных митохондриях.

Схематическая организация кукурузной митохондриальной плазмиды 2,3 тпн и конструкций с GFP, использованных в качестве субстратов для импорта в митохондрии (A). Экспрессия генов orf1 и gfp в растительных митохондриях, показанная методом RT-PCR (B) и транскрипции in organello с последующей Southern-блот гибридизацией (C).

При исследовании механизма транспорта ДНК в растительные митохондрии  установлено, что в этом процессе участвуют белки наружной и внутренней мембран органелл. С использованием антител, специфичных к белку наружной митохондриальной мембраны порину, показана необходимость этого белка для осуществления транспорта ДНК в митохондрии. Ингибиторный анализ с применением таких специфичных к белку-переносчику АДФ и АТФ в митохондриях лигандов, как атрактилозид и бонгкрековая кислота, продемонстрировал, что основным белком внутренней митохондриальной мембраны, участвующим в транспорте ДНК, является адениннуклеотидтранслоказа. Сделано заключение о том, транспорт ДНК через митохондриальную мембрану является энергозависимым процессом и происходит с участием белка в составе наружной митохондриальной  мембраны - порина и белка-переносчика в составе внутренней митохондриальной мембраны - адениннуклеотидтранслоказы.

Для изучения возможности стабильной амплификации импортируемой в митохондриальный геном растений ДНК использована стратегия, основанная на протекающих в растительных митохондриях рекомбинационных процессах. Созданы две конструкции с интегративными свойствами, одна из которых содержит частичную последовательность гена gfp, фланкированного уникальным фрагментом ДНК-повтора размером 5.27 нт из митохондриального генома кукурузы (DR-Zm/gfp), во второй конструкции ген gfp встроен в последовательность фрагмента гена nad2 из картофельного мт-генома (nad2-St/gfp). Импорт радиоактивно меченых конструкций в митохондрии кукурузы и картофеля in organello показал, что в случае картофельных митохондрий с мтДНК ассоциируется лишь последовательности nad2-St/gfp конструкции, в то время как при использовании для импорта кукурузных митохондрий ассоциация высокомолекулярной мтДНК происходит с последовательностями обеих конструкций. С использованием различных методических подходов (рестрикционный и электрофоретический анализ выделенной после импорта мтДНК в нативных и денатурирующих условиях, амплификация с использованием инверсионных праймеров лигированного фрагмента мтДНК, предположительно содержащего вставку интегрированной генетической конструкции) доказано, что наблюдаемая ассоциация импортируемого материала с высокомолекулярной мтДНК является следствием рекомбинативной интеграции вводимых последовательностей в митохондриальную ДНК. Продемонстрировано, что такого рода рекомбинация может происходить и при импорте данной конструкции в митохондрии табака. Интеграция вводимого гена-репортера в мт-ДНК происходит без дупликаций и делеций по фланкирующим ген-репортер последовательностям. Показано, что обмен гомологичными последовательностями происходит в пределах 0,5-0,6 тпн гомологии по обеим сторонам гена-репортера и не требует жесткой гомологии между встраиваемой последовательностью и мт-ДНК.

Генетическая трансформация митохондрий растений путем введения целевых генов в системе in vivo

Наличие природного механизма переноса ключевых информационных макромолекул в митохондрии открывает принципиально новые возможности как для фундаментальных исследований генетических процессов в этих органеллах, так и разработки методов митохондриального трансформации в биомедицине и биотехнологии сельскохозяйственных растений и животных с целью улучшения у них признаков митохондриального кодирования и наследования. 
Для решения задач по генетической трансформации митохондрий табака in organello и in vivo получены генетические конструкции со свойствами интегративных векторов, содержащие в своем составе селективный, репортерный и целевой гены под контролем митохондриальных промоторов. В качестве селективного гена использован модифицированный ген апоцитохрома b табака, единичная нуклеотидная замена в структуре которого обеспечивает устойчивость клеток к действию ингибитора транспорта электронов в митохондриях  антимицина A.  В качестве целевого гена выбран ген антиоксидантной защиты митохондрий кукурузы – Mn-содержащей супероксиддисмутазы sod3.1, последовательность кДНК которого была клонирована и секвенирована.

Конструкции, содержащие в своем составе последовательность репортерного гена gfp, были использованы в пилотных экспериментах по биобаллистической трансформации суспензионной и каллусных культур клеток табака. В результате ПЦР-анализа ДНК трансформантов показано наличие в клетках трансформантов гетерогенной последовательности гена gfp вводимых конструкций.

Исследована альтернативная возможность введения генетического материала в митохондрии in vivo с помощью метода вакуумной инфильтрации. Для этого использована специально полученная векторная конструкция с интегративными свойствами (atp8RcoxL/preatp1gfp), в которой ген gfp находится в составе  полицистронной единицы митохондриального генома табака. Введение этой конструкции в высечки из листьев табака путем биобаллистической трансформации и/или вакуумной инфильтрации позволило получить растительный материал первоначально в виде каллусной культуры клеток, из которой затем получены целые растения. В подвергнутых трансформации конструкцией с геном gfp листовых высечках обнаружено наличие зон флуоресценции, обусловленной, по всей вероятности, экспрессией этого гена. С помощью ПЦР и ОТ-ПЦР анализа показана интеграция использованной векторной конструкции в митохондриальный геном табака и экспрессия репортерного гена gfp.

В качестве подхода для изучения возможности введения трансформированных митохондрий в клетки был применен анализ ассоциации маркированных органелл с клетками HeLa. Установлено, что при инкубации клеток HeLa с митохондриями, окрашенными CellMask Orange, происходит окрашивание этим красителем клеточной мембраны, что свидетельствует о наличии контакта между клеточной и митохондриальной мембранами. Показано, что интенсивность окрашивания клеточной мембраны коррелирует с концентрацией митохондрий в образце и подтверждает гипотезу о том, что митохондрии могут проникать в клетки HeLa. При инкубации клеток HeLa с митохондриями, мечеными флуоресцеинизотиоцианатом, флуоресцентный сигнал присутствует как на поверхности, так и внутри клеток, указывая на то, что митохондрии картофеля, вероятно, могут быть использованы в качестве «векторов» для доставки ДНК в эукариотические клетки.